1 - Méthode classique de culture de mycélium sur boites de Pétri
Les recettes possibles pour la préparation sont les suivantes:
1 - PDA. milieu gélosé de dextrose et d'extrait de pomme de terre
Ingrédients: 200 g de pomme de terre en morceaux, 20 g de poudre d'agar, 20 g de dextrose ou de sucre de canne blanc ordinaire, I litre d'eau distillée.
Laver, peser et couper les pommes de terre en petits morceaux. Les faire bouillir pendant environ 15 à 20 minutes jusqu'à ce qu'elles ramollissent. Retirer les pommes de terre et ajouter de l'eau au bouillon pour obtenir exactement l litre. Ajouter la dextrose et l'agar en veillant à l'exactitude des quantités, faute de quoi le mélange deviendrait trop mou ou trop dur. Mélanger de temps en temps et chauffer doucement jusqu'à ce que l'agar ait fondu. L'agar ne doit pas être chaud quand on le verse dans les tubes ou les bouteilles, sinon il forme des grumeaux. Remplir les tubes avec 10 ml de liquide, puis fermer à l'aide d'un bouchon de coton.
2 - Milieu de décoction de son de riz
Pour la conservation des cultures, la recette précédente de PDA est couramment utilisée mais pour multiplier des cultures, la recette suivante est moins chère et plus facile a réaliser. On l'utilise pour la Volvariella, le Pleurotus et l'Auricularia aux Philippines.
Ingrédients: 200 g de son de riz, l litre d'eau, 20 g de gélatine. Faire bouillir le son de riz environ 10 minutes dans l'eau. Filtrer, recueillir le bouillon, y faire fondre la gélatine et verser dans les bouteilles.
3 - Agar + blé
Ingrédients: 32 g de blé, eau déminéralisée, 2 % d'agar. Faire bouillir les grains de blé dans I litre d'eau déminéralisée pendant 2 heures. Filtrer le bouillon au bout de 24 heures et ajouter de l'eau déminéralisée jusqu'à l'obtention d'un litre. Utiliser 2 % d'agar pour solidifier le bouillon. Remplir les éprouvettes et stériliser 30 min.
4 - Malt + agar a 2 %
Ce milieu est couramment utilise dans les collections de cultures, pour l'obtenir on dilue du malt de brasserie avec de l'eau, dans une solution de sucre à 10 % (mesurée à l'aide d'un étalonneur Brix à saccharose, valeur 10). Stériliser pendant 20 minutes à 121 °C. Utiliser une solution de 0,40 litre d'extrait de malt, 0,80 litre d'eau et 15 g d'agar. Ajuster la valeur du pH à 7 en ajoutant de l'hydroxyde de potassium (KOH). Remplir les tubes et stériliser 30 min. Ce milieu contient un complexe de vitamine B et divers saccharides.
5 - Farine d'avoine + agar
On peut préparer un milieu pauvre en substances nutritives en enveloppant des flocons d'avoine (30 g/l d'eau) dans un linge; on met à mijoter 2 heures dans une casserole. Presser et filtrer à travers un linge. Ajouter 15 g d'agar pour solidifier le bouillon. Ne pas stériliser à haute pression sinon l'agar ne se solidifiera pas. Conserver les éprouvettes à 102 °C et 1 atmosphère.
2 - Culture sur poudre de riz brun
Il est probable que la recette fonctionne avec une autre céréale bio (blé, orge,...)
3 - Culture de mycélium sur carton
Le carton est un milieu de culture « sélectif » car il est pauvre en nutriment et sucre. La plupart des contaminants ont besoin de sucre dans le substrat pour se développer alors que le mycélium (d’espèces poussant sur du bois) peut se contenter de carton. Lors du clonage d’un champignon sur carton, votre mycélium pousse sur un substrat qui augmente les chances de stérilité de la culture.
Commencez par découper un morceau de carton (brun et non imprimé) d’environ 3cm de coté et essayez de décoller la couche supérieur (si le carton est trop collé, trempez le dans de l’eau chaude pendant une minute.)
Grattez à l’aide d’un scalpel ou d’une lame propre la colle qui reste sur la partie ondulée du carton.
Faites trempez ensuite vos morceaux de carton dans une petite casserole à feu doux pendant 10 minutes en évitant l’ébullition.
Déposez ensuite vos morceaux de carton dans des pots en verre ou des boites de Pétri stérilsés (en les passant à l'éthanol 70% et/ou sous UV) ou les bocaux en verre (les faire bouillir). Le carton doit être bien humide mais pas complétement imbibé d’eau (laissez le égoutter quelques instants).
Maintenant il vous reste à trouver un champignon afin d’effectuer un prélèvement de tissu pour le clonage du mycélium, et à le déposer sur votre carton. Placez-le ensuite dans votre incubateur et patientez 1 à 2 semaines afin que le mycélium recouvre complètement sa surface.
Vous pouvez ensuite vous servir de vos morceaux de carton colonisés pour inoculer différents substrats.
4 - Culture liquide de mycélium
Une culture liquide (CL) est une solution d’eau sucrée et stérile dans laquelle vous allez cultiver et multiplier le mycélium de l’espèce choisie. Le but de la culture liquide est de vous permettre d’inoculer votre substrat (paille ou céréales par exemple) ou une nouvelle culture liquide. La CL permet de conserver une espèce mais aussi de la reproduire à volonté. La culture liquide minimise les risques de contaminations et peut servir pour cloner un champignon frais.
Choix du récipient:
Une culture liquide peut être réalisée dans tout récipient en verre possédant une fermeture hermétique (pot de confiture, bouteille de jus de fruits,…)
Néanmoins, il est préférable de faire plusieurs petits volumes au lieu d’un gros: si vous faites une culture liquide de 1L et qu’elle est contaminée votre espèce sera perdue. Alors que si vous préparez 4 cultures liquides de 100mL et qu’une est contaminée, il vous reste toujours les 3 autres.
Pour cette raison, je recommande l’utilisation de petits récipients et je trouve les minis pots de confiture (30 grammes) parfaits pour la culture liquide.
Vous pouvez optionnellement percé un petit trou dans le couvercle et le reboucher proprement avec du silicone. Cet astuce vous permet d’augmenter la stérilité de la manipulation en n’ayant plus besoin d’ouvrir le couvercle: transpercez directement le silicone avec l’aiguille de la seringue de spore ou d’une CL.
La solution utilisée n’est rien d’autre que de l’eau et 4% de sucre. L’eau du robinet convient bien cependant certaines limites le développement du mycélium et dans ce cas vous pourrez utiliser de l’eau en bouteille. Vous pouvez vous servir de différentes sortes de sucres comme le miel ou un mélange de glucose-saccharose en poudre, mais le plus simple reste le sirop! Beaucoup de sirops de fruit peuvent être utilisés tant que l’ingrédient principal est « sirop de glucose-fructose » car le saccharose (sucre blanc) ne convient pas seul. Vous doserez à hauteur de 50mL de sirop pour 1L d’eau.
En moyenne, le mycélium devrait commencer à se développer après 48h à 72h après inoculation. Certaines espèces sont plus lentes, mais en général, si après 96h, rien ne se développe il y a de grandes chances que la culture liquide soit contaminée.
Comment réaliser une culture liquide ?
Préparation:
Pour faire une culture liquide vous devez commencer par préparer votre récipient et votre mélange d’eau sucrée comme expliqué ci-dessus.
Stérilisation:
Une fois que vos récipients sont prêts vous devez les stériliser:
- Fermez les couvercles de vos pots et posez-les dans le panier de l’autocuiseur.
- Allumez le feu et comptez 20 à 25 minutes après le sifflement de la soupape de l’autocuiseur puis coupez le feu.
- Retirer la soupape pour faire redescendre la pression et laissez refroidir vos pots jusqu’à ce qu’ils soient à température ambiante.
Cette étape doit être réaliser avec un maximum de stérilité afin de lutter contre les vecteurs de contaminations. Comme vos pots sont étanches et ont été stérilisés, il se crée un vide à l’intérieur. Vos pots produiront un « claquement » à l’ouverture et de l’air contaminé peut être aspiré. Pour évitez cela vous pouvez injecter de l’air stérile avec une seringue par le bouchon de silicone.
Pour remplir votre seringue d’air stérile, il vous suffit d’aspirer lorsque l’aiguille est rougie par une flamme. Si vous n’avez pas réalisé de bouchon en silicone je vous recommande d’ouvrir le couvercle avec un mouchoir imbibé d’alcool et de refermé aussitôt que le vide est compensé.
Vous pouvez inoculer votre culture liquide avec:
- un morceau de chair d’un champignon.
- une seringue de spores : pensez à reboucher le silicone afin que le pot reste hermétiquement fermé après l’injection.
- un morceau de culture sur agar-agar
- une autre culture liquide: A l’aide d’une seringue dont vous aurez fait rougir l’aiguille aspirer la culture liquide, désinfectez le silicone à l’alcool puis percez-le pour injecter.
- une empreinte de spores.
Utilisation:
-Secouez vivement votre récipient de culture liquide afin de « casser » le mycélium en petits morceaux.
-Aspirez la culture avec une seringue dont vous aurez chauffé l’aiguille (du plus gros diamètre possible pour que le mycélium puisse passer) à la flamme (laisser refroidir avant d’aspirer)
-Utilisez votre mycélium comme une seringue de spores.
Conservation:
Lorsque le mycélium arrête de se développer, vous pouvez conserver votre culture liquide au frigo (plus d’une année).