Préparation du agar

Cela se décompose en deux étape :

1. Préparation de la solution nutritive (agar)
2. Versage dans les boîtes de Pétri (ou petits bocaux)

Préparation de la solution de agar

Ce qui suit est valable pour 1 litre de solution. Pour ma part je n'en prépare que 5 dl à chaque fois.

• Dans une casserole, délayez 20 g. de agar-agar (ou gélose ou gélatine) dans 1 litre d'eau froide.
• Une fois que c'est parfaitement délayé, versez 20 g. de croquettes pour chat broyées. Bien mélanger.
  
  Nota: la méthode alternative classique consiste à préparer une solution de PDA (Potatoe Dextrose Agar): faire bouillir 200 g de pommes de terre non épluchées dans un litre d'eau. Filtrez et diluer dans l'eau encore chaude 20 g d'agar-agar et 15 g de sucre.
  
  
• Choisissez les récipient : pour ma part j'utilise des bouteilles achetées en pharmacie (elles sont aussi vendues vides) pour contenir du désinfectant : elles sont en verre solide, ont un bouchon qui se visse et un goulot étroit. Elles peuvent être utilisées un grand nombre de fois. J'utilise celle de contenance de 2.5 dl.
  
• Mettez le bouchon et vissez-le un peu : il doit subsister du jeu. Ajouter du papier d'allu sur le bouchon, descendant jusqu'é 2 cm en dessous de sa base.
• Stérilisez durant 30 mn. à la marmite à vapeur. Laissez refroidir doucement la marmite, sinon des bulles vont se former dans les bouteilles et faire déborder la solution.
• Une fois les bouteilles tièdes/chaudes, elles sont prêtes à être utilisées. Si vous désirez les stocker pour les verser dans les boîtes de Pétri une porchaine fois, mettez un élastique autour du goulot et serrez le bouchon sans enlever le papier d'allu.

Versage dans les boîtes dePétri

Si vous avez stockés vos bouteilles contenant la solution de agar stérile, la solution s'est figée : il faut la réchauffer au bain-marie :

Sans enlever le papier d'allu, désserez les bouchons et faire chauffer doucement au bain marie, jusqu'à la dissolution entière de la masse gélatineuse. Avant de faire ceci, vérifiez quand même que la surface du agar dans la bouteilles soit vierge vie (contamination).

Il faut maintenant verser dans les boîtes : ceci se déroulera dans la boîte à inoculation : Attention aux procédures d'hygiènes à respecter.

• Déballez avec précaution les boîtes de Pétri : Evitez absolument de soulever leur couvercle, ouvrez leur emballage au minimum, ne sortez que le nombre de boîtes que vous allez préparer en faisant en sorte que le moins d'air possible ne rentre dans l'emballage, puis fermez ce dernier hermétiquement à l'aide d'un élastique.
• Mettre les boîtes de Pétri dans la boîte à inoculation, ainsi que une bouteille de solution de agar encore chaude.
• La suite se déroule dans des conditions de stérilité (mains propre au travers des trous de la boîte à innoculation)
• Serrez le bouchon de la bouteille de solution et mettez-la à l'envers plusieurs fois pour mettre en suspension les particules qui sont descendues vers le fond.
• Enlevez le bouchon, soulevez d'une main le couverlcle d'une boîte de Pétri, versez jusqu'à la moitié de la hauteur de la boite. Refermez.
• Procédez de même pour les autres boîtes de Pétri. Toutes les 2-3 boîtes secouez un peu la bouteille, pour mettre les particules en suspension.

Laissez la solution se réfroidir dans la boîte à inoculation, une fois qu'elles auront réfroidit à moins de 30 deg. C., elle sera utilisable pour une inoculation de spores ou de solution de spore/mycélium.

Je vous rappelle que c'est une bonne idée de laisser une boîte de Pétri non-inoculée pour vérifier que vous avez réalisez les étapes décrites ici de manière stérile.

Alternative aux boîtes de Pétri

Si vous éprouvez de la peine à achetez des boîtes de Pétri, vous pouvez toujours utiliser des bocaux. Ils doivent :

• Avoir un bouchon qui se visse.
• Etre large. Avoir une ouverture large.
• Etre peut haut.

La procédure de préparation est légèrement différente que pour les boîtes de Pétri :

• Préparez la solution nutritive, mais versez-la directement dans les petits bocaux. En mettre 1/2-1 cm.
• Mettre les couvercles sans trop les visser, recouvrir le couvercle de papier d'allu.
• Stérilisez durant 30 mn à la marmite

Une fois refroidits à 30 deg.C., ils sont près à être inoculés avec des spores ou de la solution de spore/mycélium.

L'inconvénient par rapport aux vraies boîtes de Pétri, c'est que les manipulations à l'aide du scalpel et de la boucle seront peut-être plus difficiles.